Page 35 - Revista Científica Biofar

33
inducción de iceA1 por contacto de la
bacteria con el epitelio gástrico, y en algunas de un bisturí. La extracción se realizó
poblaciones el genotipo iceA1 se ha asociado
con la presentación de úlcera péptica (17,18,19) . para la conservación de ADN se utilizó agua
En Bolivia no se cuentan con datos sobre el
tipo de Helicobacter pylori y la frecuencia
de los tipos virulentos que se encuentran Para verificar la presencia de ADN, se
infectando la mucosa gástrica de pacientes
con diferente grado de gastropatías.
Tampoco se ha descrito la presencia de
coinfecciones en estos pacientes.
El objetivo principal de este trabajo de
investigación, fue identificar genes de
virulencia en biopsias positivas a
Helicobacter pilory, de pacientes que
acudieron a la Clínica los Olivos y
determinar la asociación con las diferentes
patologías gástricas.
MATERIALES Y MÉTODOS
En el presente estudio se trabajó con un total
de 78 muestras de biopsias gástricas de
pacientes que dieron positivas la prueba de
la ureasa y la técnica molecular de
identificación de Helicobacter pylori. Las
muestras fueron colectadas de pacientes que
acudieron a la Unidad de Gastroenterología
de la Clínica Los Olivos de la ciudad de
Cochabamba, Bolivia de septiembre a
diciembre del año 2015.
Se obtuvo un consentimiento informado de
los pacientes y se llenó un formulario
diseñado para la obtención de datos.
El diagnóstico endoscópico fue realizado por
los médicos especialistas de la Clínica Los
Olivos de la ciudad de Cochabamba.
Las biopsias fueron obtenidas de la región
del antro y llevadas en el día en cadena de
frío al laboratorio. Para la identificación de la tabla 1.
los genes de virulencia se realizó la
extracción de ADN y se realizaron las
pruebas moleculares para la identificación
de los genes de virulencia, seleccionados
para este estudio.
Extracción de ADN.
La extracción de ADN, se realizó utilizando
el Kit FAVORGEN; las biopsias fueron
–
C
O
I
E
B
F
BIOFAR – CIENTIFICA 3 3
I
F
T
N
I
A
R
A
I
C
trozadas sobre un portaobjetos con la ayuda
siguiendo las instrucciones del fabricante,
o
de alta pureza y fue conservado a -20 C
hasta su utilización en la PCR
realizó la cuantificación utilizando un
fluorómetro QUBIT 2.0.
R
Reacción en cadena de la polimerasa para
identificar los virotipos de H. pylori.
Con las muestras que dieron positivas para
H. pylori, se realizó la amplificación para
identificar diferentes genes de virulencia.
Los genes que fueron detectados fueron.
cagA y babA2; vacA s1/s2; vacA m1/m2 y
los genes ice A1 e iceA2.
Se realizaron varias pruebas preliminares
variando las temperaturas de hibridación, la
concentración de cloruro de magnesio, la
cantidad de ADN y la concentración de los
dNTPs. Este trabajo previo, permitió obtener
procedimientos estandarizados.
Para la identificación de algunos genes se
utilizaron PCR múltiple y en otros PCR
simples.
Amplificación por PCR para los genes
cagA y bab2.
Para la amplificación de estos genes se
estandarizó una PCR múltiple. Donde las
concentraciones finales fueron buffer, 1x,
MgCl 2, 1,5 mM; dNTPs 200uM; cebadores
0,5uM de cada uno, Taq polimerasa 1 U por
reacción y 3 ul de ADN.
Los cebadores utilizados fueron los
recomendados en otros estudios (15, 20) La
secuencia de los cebadores se encuentra en
Como Control (+), se utilizó el ADN de
Helicobacter pylori ATCC 43504, Control
(-) E. coli ATCC 35218
Las condiciones para amplificación
simultanean fueron, desnaturalización inicial
o
94 C por 5 minutos, 35 ciclos de
o
desnaturalización a 94 C por 1 minuto,
hibridación a 56°C por 1 minuto, elongación
o
a 72 C por 1 minuto y una elongación final