Page 36 - Revista Científica Biofar

4
3
34 BIOFAR – CIENTIFICA

I
C
–
A
R

T
I
E
N
C
A
F
I
B
I
F
O
a 72 C por 5 minutos. Esta amplificación se visualizados sobre un transiluminador de luz
o
llevó a cabo en un termociclador marca UV, de BIORAD.
BIORAD. Los productos obtenidos fueron, para
Los productos de amplificación de 349 pb vacAs1 de 259pb, vacAs2 de 286pb; vacAm1
para cagA y 831 pb para babA; fueron de 567pb; vacAm2 de 642pb.
separados por electroforesis en gel de
agarosa 1,2% y visualizados en un PCR para iceA1 e ice A2
transiluminador de luz UV, después de dejar Para los genes, iceA1 e ice A2 la
en una solución de bromuro de etidio a una amplificación se realizó por separado debido
concentración de 0,5ug /ml a las temperaturas de hibridación, de 55° y
o
50 C respectivamente; siguiendo el
(21)
PCR múltiple para genes VacA s1/s2; protocolo descrito por Esawi .
VacA m1/m2. Los componentes utilizados para la PCR
Para la amplificación del gen vacA y los fueron: buffer, 1x; MgCl 2 1,8 mM; dNTPs
diferentes alelos de las regiones señal y 280uM; cebadores 0,5uM de cada uno, Taq
media s1/s2 y m1/m2, se realizó una PCR polimerasa 1 U por reacción y 3 ul de ADN.
múltiple utilizando 2 pares de cebadores Como Control (+) se utilizó el ADN de
(tabla 1), descritos en el trabajo de Bravata Helicobacter pilory ATCC 43504, Control
y empleados inicialmente por (-) E. coli ATCC 35218
Chattopadhyay y col (20) Las condiciones para amplificación para
Las concentraciones de los diferentes iceA1 fueron, desnaturalización inicial 94 C
o
componentes de la PCR fueron: buffer, 1x; por 5 minutos, 35 ciclos de desnaturalización
MgCl 1,8 mM; dNTPs 320uM; cebadores a 94 C por 1 minuto, hibridación a 55 C; por
o
o
2
0,5uM de cada uno, Taq polimerasa 1,5 U 1 minuto, elongación a 72 C por 1 minuto y
o
o
por reacción y 3 ul de ADN. una elongación final a 72 C por 5 minutos.
Como Control (+), se utilizó el ADN de Esta amplificación se llevó a cabo en un
Helicobacter pilory ATCC 43504, Control termociclador marca BIORAD. El tamaño
(-) E. coli ATCC 35218 del producto de amplificación de 558pb.
Las condiciones finales fueron: Para iceA2, el premix se preparó de la
o
desnaturalización inicial 94 C por 5 minutos, misma manera, las condiciones de
o
35 ciclos de desnaturalización a 94 C por 1 amplificación similares, con la variable que
o
o
minuto, hibridación a 55 C; por 1 minuto, la temperatura de hibridación fue de 50 C
elongación a 72 C por 1 minuto y una con un producto de 120pb.
o
elongación final a 72 C por 10 minutos. Esta
o
amplificación se llevó a cabo en un Análisis estadístico.
termociclador marca BIORAD. Con los resultados obtenidos se elaboraron
Una vez realizada la PCR, se llevó a cabo la tablas de frecuencia y otras para la
electroforesis con el fin de separar los interpretación correcta de los resultados, se
productos obtenidos, utilizando un gel de utilizaron tablas de contingencia para la
agarosa a 1,2%; una fuente de poder marca obtención de chi cuadrado de Pearson en el
BIORAD, y una cámara de electroforesis de programa SSPS.
la misma marca, posteriormente se realizó la Los cebadores utilizados se encuentran
tinción con bromuro de etidio 0,5ug/ml y descritos en la tabla 1.