Page 12 - Revista Científica Biofar

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y metalobetalactamasas se analizaron
mediante el test de Hodge, Hodge con
sulfato de zinc/EDTA y test de doble disco
(DDST). En los test de Hodge se utilizó la
cepa control E. coli ATCC25922 sensible a
imipenem .
(25)
Detección genotípica de carbapenemasas:
La detección genotípica de los genes
carbapenemasa bla OXA-58, bla OXA-51 ,
bla OXA-23 bla OXA-40 y bla OXA-143 se
llevó a cabo mediante multiplex PCR.
También se analizaron los genes metalo-
betalactamasas (IMP,GIM, VIM, SPM y
NDM-1) mediante PCR utilizando los
primers específicos y condiciones
previamente descritos (6, 26, 27) .
Secuenciación de los genes bla OXA-58 y
bla OXA-23: Se llevó a cabo la extracción
de las bandas correspodientes del gel de
agarosa y una vez purificadas se enviaron a
secuenciar (SECUGEN SL., Madrid).
Detección de estructuras genéticas móviles: La
detección de integrones de clase 1 se llevó a cabo
mediante PCR con los iniciadores 3’CS (5’- Para conocer el nivel de resistencia se
AAAGCAGACTTGACCTGA- 3’) y 5´CS (5’-
GGCATCCAAGCAGCAAG- 3’) .
(28)
Para detectar cada una de las secuencias de
inserción se amplificó el ADN mediante
PCR con los iniciadores correspondientes:
para ISAba 1, ISAba 1F con ISAba 1R; para
ISAba 2, ISAba 2F con ISAba 2R; y para
(29)
ISAba 3, ISAba 3F con ISAba 3R .
El aislamiento de ADN plasmídico se llevó
a cabo utilizando los kits comerciales Mini
and Midi plasmid extraction kit (QIAGEN).
Previamente se hizo un tratamiento con
proteinasa K a una concentración de 50
mg/ml que mejoraba el rendimiento de la
extracción para A. baumannii. El contenido
de plásmidos se analizó mediante
electroforesis en geles de agarosa al 0.7%, y
el tamaño se determinó por comparación con
los ADN plasmídicos de las cepas control
E.coli NCTC 50193 (CECT 678) y NCTC
59192 (CECT 679) que contienen plásmidos
de tamaños de 2, 2.5, 2.8, 3.6, 5, 5.8, 8.6 y
53.3 Kb en el primer caso y 7.6, 39.8, 70 y
163.3 Kb en el segundo (30) .
También se analizó el contenido plasmídico
mediante electroforesis en campos pulsados
(PFGE) previamente digerido con la enzima
S1 de los aislamientos de A. baumannii del
año 2015 que presentaban los genes
bla OXA-51 y bla OXA-23 .
Localización de los genes bla OXA-58 y
bla OXA-23 : La extracción de ADN
plasmídico separada en geles de agarosa se
transfirió a una membrana de nylon mediante
Southern Transfer y posteriormente se realiza
la hibridación con una sonda de los genes a
estudiar (bla OXA-58 y bla OXA-23 ) marcada
con digoxigenina siguiendo el protocolo
(31)
previamente descrito .
RESULTADOS
seleccionaron los antibióticos de mayor
relevancia en el tratamiento de las
infecciones causadas por A. baumannii. El
estudio de resistencia a los antibióticos se
llevó a cabo mediante la técnica disco-placa
y concentración mínima inhibitoria (CMI),
en las que se pudo comprobar que en el año
2008, A. baumannii mostró valores de
resistencia en torno al 70% en la mayoría de
los antibióticos y en el año 2015 los valores
fueron del 95% de resistencia, excepto para
amikacina. En cuanto a los carbapenems, en
el año 2008 imipenem y meropenem
mostraron un porcentaje de resistencia del
33% y 42% respectivamente, y en el año
2015 fue del 95,1% de resistencia para
ambos antibióticos, además en este mismo
año se detectó un aislamiento resistente a
colistina (Figura 1).